时间分辨比率荧光纳米温度计用于肿瘤消融实时内窥镜温度引导

　　导读：热消融是一种常用的早期癌症治疗手段，但由于缺乏实时温度成像反馈方法，存在消融不完全或过度的风险。近日，复旦大学团队在材料科学顶刊《Advanced Materials》发表最新研究，提出了一种基于时间分辨比率荧光纳米温度计(TR-FNT)的创新技术，结合像增强型sCMOS(IsCMOS)相机，实现了肿瘤热消融术中实时、高精度的温度监测。该技术通过铕(Eu)和铱(Ir)复合物的独特光物理特性，克服了生物组织自体荧光和波长依赖性光衰减的干扰，在活体实验中展现了0.02 K的温度分辨率、6.9% K⁻¹的热灵敏度以及10帧/秒的实时成像速度。研究进一步开发了柔性内窥镜系统，成功应用于兔肝肿瘤的精准消融，为临床术中温度导航提供了全新解决方案。

　　研究背景

　　热消融技术(如微波消融、射频消融)因其微创性和高效性，已成为早期肿瘤治疗的首选方案。然而，术中缺乏实时温度反馈易导致消融不全或过度损伤，影响治疗效果。传统荧光纳米温度计受限于生物组织的自体荧光和光散射，信号提取精度低;而现有比率型温度计虽能提升成像速度，但依赖波长分辨的信号分离易受组织吸收差异干扰。针对这些问题，本研究提出了一种时间分辨比率方法，通过Eu和Ir复合物的荧光寿命差异实现信号分离，结合IsCMOS相机的高时间分辨率，显著提升了深层组织内的温度监测能力。

　　实验方法与装置

　　纳米温度计的制备与表征

　　研究团队以新型铕复合物 Eu(tta)3TADF 为温度敏感材料，铱复合物Ir(tfpqz)2dbm为温度惰性参考，分别将它们与抗氧化剂溶解在丙酮中，滴加到聚苯乙烯(PS)微球溶液中，经过搅拌、离心、洗涤等步骤制备出Eu PS 和Ir PS。随后将Eu PS 溶液和Ir PS 溶液混合，加入乙醇、氨水和四乙氧基硅烷等最终制备出Ir&Eu PS@SiO2 纳米粒子溶液。通过透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、能量色散 X 射线光谱(EDS)等技术对纳米粒子的形貌、尺寸分布、元素组成等进行了表征，如图 1a-1e 所示。

　　图1 荧光纳米温度计的合成过程与表征。a) Eu和Ir复合物的化学结构及能级设计;e) TEM图像显示PS@SiO₂核壳结构;f) 温度依赖的荧光光谱，Eu信号随温度升高显著衰减。

　　基于 IsCMOS 相机的时间分辨比率荧光测量系统

　　荧光衰减曲线显示两个不同阶段，分别对应Ir(688 ns)和Eu(549 μs)的发光衰减(图1g)。Ir和Eu的荧光寿命均比生物自体荧光(ns级)长多个数量级，从而可通过时间门控技术消除自体荧光。Ir和Eu信号在寿命和热响应上的显著差异确保了其信号分离的可行性(图1h)。采用时间分辨增强型sCMOS(IsCMOS)相机构建荧光测量系统。该相机具备时间门控检测功能，能够通过同步激光触发和时间门控，在纳秒级精度下实现信号采集。设置两个时间门以基于寿命差异分离Ir和Eu的发射信号。第一个时间门同时收集Ir和Eu的发射信号，并在时间域过滤自体荧光;第二个时间门通过排除Ir信号分离出Eu发射信号(图2b)。为最大化信号采集效率，根据纳米温度计的光物理特性优化激发频率(60 kHz)、激光开启时长(10 μs)及时间门设置。实际激光关闭和Ir发射终止时间点分别确定为约10.8 μs和12.8 μs(图2c)。因此，在激光关闭后设置两个宽度为2 μs的时间门(10.8–12.8 μs和12.8–14.8 μs)收集荧光信号。每个序列中，依次捕获两幅时间门控荧光图像，并通过像素级计算生成比率图像，其中每个像素的平均值代表对应条件下的比率。

　　图2 IsCMOS时间门控原理及抗干扰性能对比。a) 成像系统示意图;g) 不同组织厚度下TR与WR方法的比率稳定性对比。

　　实时温度成像系统(RTIS)的构建

　　利用IsCMOS相机的高速时间门控荧光图像捕获功能，结合MATLAB 软件进行在线像素级比率到温度的转换，构建了实时温度成像系统。该系统能够在10fps的最大成像速度下对160万个像素进行实时处理，实现温度的快速、精准测量。

　　实验结果

　　纳米温度计的性能测试

　　在30 - 96°C 的温度范围内，纳米温度计的荧光强度比值与温度呈良好的相关性，遵循 Boltzmann 函数关系。基于时间分辨比率(TR)方法的纳米温度计相比传统的波长分辨比率(WR)方法，能够有效消除生物组织的吸收、散射和自荧光干扰，保持稳定的比率信号输出，实现准确的温度测量，如图 2c、2f、2g、2h 和 2i 所示。

　　体外消融实验验证

　　将纳米温度计应用于猪肝的体外微波消融实验，通过与热像仪同时测量，验证了RTIS的性能。实验结果显示，RTIS所监测到的热场分布与热像仪观察结果具有较高的一致性，且能够更精准地反映消融区域的温度变化，表明 RTIS 可作为可靠的温度监测工具，为MWA治疗提供实时热场分布信息，如图 3所示。

　　图3 温度响应曲线(a)及体外消融实验(d-g)，显示RTIS与热像仪的温度一致性。

　　荷瘤裸鼠体内消融实验

　　在荷瘤裸鼠的微波消融实验中，RTIS实时监测了肿瘤区域的热场分布。结果表明，随着消融功率的增加，有效热场逐渐增大，肿瘤组织的损伤范围也随之扩大。通过组织病理学分析(H&E 和 TUNEL 染色)，发现不同消融功率下肿瘤组织的损伤程度与RTIS所监测的热场分布一致，验证了RTIS在体内消融过程中通过对热场可视化实现精确监测的能力，如图4所示。

　　图4 小鼠肿瘤消融的实时温度图像(a)与病理结果(d)，证明功率调控对消融范围的影响。

　　基于内窥镜的荧光温度成像系统设计与应用

　　研究团队设计了一种灵活的内窥镜，与RTIS相结合，构建了荧光温度内窥镜系统。该系统通过内窥镜将激发激光传输至深层组织，收集纳米温度计的荧光信号，并经光学系统处理后由IsCMOS相机捕获，实现对深层组织的温度成像。在兔子肝肿瘤模型的消融实验中，该系统成功实现了对肝肿瘤的实时温度监测，并通过实时温度反馈协议，根据温度成像动态调整消融功率，实现了精准的消融控制，如图5所示。

　　图5 内窥镜结构(a)及兔肝肿瘤消融的术中温度反馈(e)，病理染色(f)验证精准消融效果。

　　总结

　　该研究成功开发了一种基于时间分辨比率荧光纳米温度计和IsCMOS相机的实时温度成像系统，实现了从体外到体内、从浅表组织到深层组织的全方位温度监测，在热消融手术的实时精确温度反馈方面取得了重要突破。

　　中智科仪时间分辨IsCMOS相机在其中发挥了关键作用，通过纳秒级时间分辨能力有效分离不同寿命荧光信号。在此之前，客户利用中智科仪逐光IsCMOS相机测试了稀土纳米粒子的荧光寿命成像，得到的寿命拟合结果与荧光光谱仪得出的数据相一致，这证明了相机在荧光寿命成像方面的高准确性，相比于传统的基于时间相关单光子计数(TCSPC)的荧光寿命测量方法，IsCMOS相机测量荧光寿命的效率大大提升，可快速采集数据获得寿命曲线。